Technika SEC-MALS (ang. Size Exclusion Chromatography with Multi-Angle Light Scattering) to metoda służąca do analizy białek, polimerów oraz nanocząstek. Wykorzystanie detektora tego typu wraz z UV i RI w chromatografii wykluczenia umożliwia określenie masy molowej oraz rozkładu wielkości cząstek w próbce. Próbka badana jest rozdzielana na podstawie jej wielkości za pomocą kolumny chromatograficznej. Opuszczające kolumnę cząstki przechodzą przez wiązkę lasera pod różnymi kątami, a rozproszone światło jest rejestrowane przez detektor.
Poniżej przedstawiono jak wykorzystując wyżej wspomnianą technikę zbadano proces agregacji białka β-laktoglobuliny w różnych warunkach. Dodatkowo na przykładzie surowiczej albuminy wołowej określono jej stan oligomeryczny.
METODA SEC-MALS
Chromatografia wykluczenia sprzężona z detektorem rozpraszania światła (SEC-MALS):
- System analityczny: DionexUltiMate 3000 sprzężony z detektorem UV-VIS, detektorem RefractoMax 520 ERC (RI) oraz detektorem rozpraszania światła lasera (LS) DAWN8+ (MALS)
- Oprogramowanie: Astra 6.1
Wykorzystane wzorce białkowe:
- β-lactoglobulin from bovine milk (Sigma Aldrich) – Mw ~18 kDa
- Surowicza albumina wołowa (BSA) (Sigma Aldrich) – Mw ~ 66 kDa
WYNIKI
Agregacja β-laktoglobuliny
Próbki β-laktoglobuliny o stężeniu 20 mg/ml inkubowano w 67oC w punktach czasowych 3, 5 oraz 24 godziny. Próbki po inkubacji umieszczano w łaźni lodowej, a następnie rozcieńczano do stężenia 2 mg/ml. Dodatkowo przygotowano próbkę o stężeniu 2 mg/ml bez inkubacji. Masy molekularne białka w próbkach obliczono na dwa sposoby: wykorzystując dane zebrane przez detektor LS+UV oraz LS+RI. Dla analizy z wykorzystaniem detektora UV przyjęto następujące parametry: dn/dc (mL/g) = 0,1850; UV Extinction Coefficient (mL/(mg*cm)) = 0,94.
Tabela 1. Masy molekularne białka β-laktoglobulina oraz powstałych agregatów.
Rysunek 1. Chromatogramy próbek β-laktoglobuliny uzyskane przy pomocy detektora MALS.
Stan oligomeryczny surowiczej albuminy wołowej
Do określenia stanu oligomerycznego użyto wzorca surowiczej albuminy wołowej (BSA) (Sigma Aldrich) o stężeniu 2 mg/ml. Masy molekularne białka w próbkach obliczono na dwa sposoby: wykorzystując dane zebrane przez detektor MALS+UV oraz MALS+RI.
Tabela 2. Masy molekularne dimerów oraz monomerów białka Surowicza albumina wołowa.
Rysunek 2. Chromatogramy dla BSA uzyskane przy pomocy detektora MALS z widocznym sygnałem od dimeru oraz monomeru.
PODSUMOWANIE
Przy zastosowaniu techniki SEC-MALS z wykorzystaniem detektorów RI oraz UV przedstawiono wpływ temperatury na proces agregacji β-laktoglobuliny. Określono również stan oligomeryczny surowiczej albuminy wołowej w badanej próbce oraz określono skład procentowy monemerów oraz dimerów BSA.
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Za pomocą tej techniki można określić stan oligomeryczny oraz wyznaczyć masę poszczególnych oligomerów badanego białka. Technika znajduje swoje zastosowanie szczególnie w badaniach stabilności białek, na przykład w badaniach biofarmaceutyków, gdzie agregacja białka może mieć znaczący wpływ na jego aktywność biologiczną. Wykorzystując technikę SEC-MALS można dobrać odpowiednie warunki przechowywania białka jak również sprawdzić czy białko jest wrażliwe na proces zamrażania i rozmrażania. W Laboratorium Chromatografii i Spektrometrii Mas JCI badamy białka i peptydy techniką SEC-MALS w zakresie mas: od 100 do 1 250 000 Da.
Kontakt w sprawie oferty:
dr Dominika Szot-Przewrocka
E: dominika.szot.przewrocka@jci.pl