ELISA, to skrót z języka angielskiego (ang. enzyme-linked immunosorbent assay) oznaczający test immunoenzymatyczny lub immunoenzymosorpcyjny fazy stałej. Jest on jedną z najbardziej popularnych i powszechnie stosowanych metod laboratoryjnych używanych do wykrywania i ilościowego pomiaru obecności przeciwciał lub antygenów w próbce biologicznej. Metoda ELISA działa poprzez powstawanie połączeń między antygenem a przeciwciałem, co prowadzi do wywołania reakcji barwnej. Ta reakcja jest możliwa dzięki wykorzystaniu enzymów skoniugowanych z immunoglobulinami oraz odpowiednich substratów. Intensywność barwy zależy od ilości utworzonych połączeń między antygenem a przeciwciałem i najczęściej jest mierzona kolorymetrycznie za pomocą spektrofotometru.
NA CZYM POLEGA METODA ELISA
Metoda ELISA została oficjalnie opisana po raz pierwszy w 1971 roku przez Evę Engvall i Petera Perlmanna, którzy do ilościowego oznaczania immunoglobulin klasy IgG zastosowali znakowane enzymem przeciwciała. Podstawowa zasada działania testu ELISA polega na wykorzystaniu reakcji immunologicznej między przeciwciałami a antygenami. Obecnie technika ELISA jest powszechnie wykorzystywana w badaniach biomedycznych zarówno w celach naukowych, jak i diagnostycznych. Jest to popularna metoda analityczna, ponieważ jest:
- szybka,
- precyzyjna,
- łatwa do wykonania,
- możliwa do automatyzacji,
- bezpieczna,
- stosunkowo niedroga
Głównym wyzwaniem podczas stosowania tej metody jest brak jednej uniwersalnej procedury, która nadawałaby się do badań różnego rodzaju materiałów. Wszystkie parametry mające istotne znaczenie dla poprawnego przeprowadzenia testu są silnie zależne od stosowanych reagentów. Dlatego przed przeprowadzeniem każdego eksperymentu wykorzystującego technikę ELISA konieczne jest dostosowanie tych parametrów poprzez optymalizację.
Standardowo testy ELISA przeprowadza się na polistyrenowych płytkach o pojemności 96 dołków, a ogólną zasadę można podzielić na 3 etapy:
- Etap 1 – polega na pokryciu (opłaszczeniu) płytki odpowiednim antygenem lub przeciwciałem, tworząc warstwę na jej powierzchni.
- Etap 2 – wolne miejsca na powierzchni płytki są blokowane poprzez zastosowanie roztworu owoalbuminy lub odtłuszczonego mleka. Ten krok ma na celu zapobieżenie nieselektywnemu przyłączaniu się białek do fazy stałej.
- Etap 3 – zachodzi reakcja antygen-przeciwciało, w której antygen łączy się ze swoim specyficznym przeciwciałem. Reakcja ta jest uwidaczniana poprzez powstanie barwnego produktu dzięki obecności odpowiednich enzymów. Najczęściej stosowanymi enzymami są fosfataza alkaliczna, peroksydaza chrzanowa (która w obecności tetrametylobenzydyny powoduje niebieskie zabarwienie) oraz oksydaza glukozowa. Zmiana barwy roztworu jest odczytywana za pomocą spektrofotometru, a wyniki są interpretowane na podstawie krzywej kalibracyjnej. Aby przygotować krzywą kalibracyjną, tworzy się roztwory o różnych stężeniach, które służą jako punkty odniesienia.
WARIANTY TESTU ELISA
Istnieje kilka różnych wariantów testu ELISA, w tym testy direct ELISA (bezpośredni), indirect ELISA (pośredni), sandwich ELISA (podwójny) i competitive ELISA (kompetycyjny, konkurencyjny). Każdy z tych wariantów ma swoje zastosowanie w zależności od badanej substancji i celu testu. Odmiana kanapkowa może być realizowana na dwa sposoby: bezpośredni i pośredni. Te różne testy różnią się w sposobie przeprowadzenia oraz zastosowaniu, a wybór odpowiedniej metody zależy od badanego materiału. Do pomiaru stężenia antygenu stosuje się odmiany kanapkową i konkurencyjną, natomiast w celu ilościowego oznaczania przeciwciał zaleca się przeprowadzenie testu bezpośredniego lub pośredniego.
- TEST BEZPOŚREDNI
Test bezpośredni jest najszybszym i najprostszym rodzajem testu ELISA. Procedura rozpoczyna się od opłaszczenia płytki antygenem, następnie inkubuje się ją z przeciwciałem pierwszorzędowym połączonym już z enzymem. Po dodaniu odpowiedniego substratu enzym zawarty w tym kompleksie katalizuje reakcję, a jej produkt jest wykrywany spektrofotometrycznie. W tej technice nie używa się przeciwciał drugorzędowych, co przyspiesza procedurę i eliminuje ryzyko reakcji krzyżowych z ich udziałem. Niestety istotną wadą bezpośredniej odmiany jest ograniczona na rynku dostępność przeciwciał znakowanych enzymem, które są specyficzne dla mało popularnych antygenów. Często wymaga to przygotowania takich koniugatów samodzielnie, co jest czasochłonne. Ta metoda dobrze sprawdza się w ilościowym oznaczaniu białek wcześniej wyizolowanych z materiału biologicznego. Jednak w przypadku pomiaru stężenia jednego z wielu białek w złożonej mieszaninie, test bezpośredni może okazać się niewystarczająco czuły i specyficzny.
- TEST POŚREDNI
W teście pośrednim, wykorzystuje się dwa rodzaje przeciwciał detekcyjnych. Pierwszym z nich jest przeciwciało pierwszorzędowe, które jest skierowane przeciwko badanemu antygenowi i służy do opłaszczenia płytki. Drugim, jest przeciwciało drugorzędowe, które jest skoniugowane z enzymem i kierowane przeciwko przeciwciału pierwszorzędowemu. Ważne jest, że znakowane przeciwciała nie muszą być specyficzne dla antygenu, ale wystarczy, że są specyficzne dla przeciwciał pierwszorzędowych. Dzięki temu można zmniejszyć koszty i wykorzystać je do badań nad różnymi materiałami biologicznymi. Test pośredni charakteryzuje się większą czułością niż test bezpośredni. Jednak jest bardziej czasochłonny, a zastosowanie drugiej warstwy przeciwciał może prowadzić do reakcji krzyżowych. Zarówno test bezpośredni, jak i pośredni są najczęściej stosowane do ilościowego oznaczania przeciwciał i badania intensywności odpowiedzi immunologicznej na różne rodzaje antygenów.
- TEST KANAPKOWY
Procedura wykonania metodą kanapkową, zwaną także testem podwójnego wiązania, jest nieco inna. Rozpoczyna się od powlekania fazy stałej warstwą przeciwciał pierwszorzędowych. Dopiero po związaniu tych przeciwciał z powierzchnią płytki, nanosi się badaną próbkę, z której wyłapane są tylko te białka, przeciwko którym są skierowane unieruchomione immunoglobuliny. Dzięki temu eliminuje się zjawisko konkurencji oznaczanego antygenu z innymi cząsteczkami obecnymi w badanym materiale, co zwiększa specyficzność testu. W zależności od potrzeb, można zastosować kolejne kroki wariantu bezpośredniego, używając tylko znakowanych enzymem przeciwciał drugorzędowych, lub wariantu pośredniego, w którym dodatkowo stosuje się warstwę detekcyjnych przeciwciał pierwszorzędowych skierowanych przeciwko oznaczanemu antygenowi. Próba z wykorzystaniem przeciwciał wychwytujących i detekcyjnych znajduje szerokie zastosowanie w wykrywaniu i ilościowym oznaczaniu białek posiadających wiele epitopów, takich jak cytokiny. Jest również najlepszym rozwiązaniem w badaniach, w których analit jest jednym z wielu rodzajów cząsteczek obecnych w próbce. W przypadku bogatej mieszaniny antygenów, na płytce pozostają tylko te, które zostaną rozpoznane przez specyficzne przeciwciała już związane z podłożem. Często konieczne jest użycie dwóch rodzajów przeciwciał, które reagują z różnymi epitopami. Jednak jeśli cząsteczka ma wiele powtarzających się epitopów, możliwe jest użycie tego samego przeciwciała zarówno do wychwytywania, jak i detekcji. Stosuje się to, na przykład, podczas wykrywania obecności całych mikroorganizmów, takich jak bakterie. Wykorzystanie testu kanapkowego skutkuje minimum trzykrotnym (a nawet pięciokrotnym i większym) zwiększeniem czułości w porównaniu z standardowymi testami, bez przeciwciał powlekających. Ze względu na wysoką czułość i stosunkową prostotę, test kanapkowy jest powszechnie stosowany przez diagnostów i naukowców. Odmiana pośrednia, czyli sandwich ELISA, jest uważana za najbardziej czułą i specyficzną, ale jednocześnie zdecydowanie bardziej czasochłonną.
- TEST KOMPETYCYJNY
W przypadku odmiany kompetycyjnej (także: konkurencyjnej, rywalizacyjnej) testu ELISA, również stosuje się przeciwciała do opłaszczenia fazy stałej, jednak, przeciwieństwie do pozostałych wariantów, używa się znakowanych antygenów, które konkurują o miejsca wiążące w immunoglobulinach z białkami obecnymi w próbce. Sygnał otrzymany z testu zależy więc od proporcji tych konkurencyjnych cząsteczek, i im mniejsze jest stężenie antygenów w badanym materiale, tym większy jest sygnał. Wariant kompetycyjny jest stosowany do ilościowego oznaczania małych cząsteczek, które nie mogą się jednocześnie wiązać z dwoma rodzajami przeciwciał. Z uwagi na niewielkie rozmiary badanych antygenów, ich bezpośrednie powlekanie do fazy stałej może być niewydajne. Ponadto, istnieje ryzyko zamaskowania epitopów tych białek przez cząsteczki obecne w roztworze blokującym. Dlatego do wykrywania i ilościowego oznaczania małych białek najlepiej sprawdza się konkurencyjna metoda ELISA. Metody ta jest szczególnie powszechnie wykorzystywana w kontrolach antydopingowych sportowców, gdzie służy do monitorowania ilości hormonów steroidowych oraz wykrywania śladów metabolitów i pozostałości leków, substancji psychoaktywnych oraz innych suplementów.
Zastosowanie testów ELISA i oferta JCI w tym obszarze
Oferujemy wykonanie testów ELISA dla szerokiej gamy matryc:
- płyny ustrojowe,
- surowica krwi,
- medium hodowlane,
- lizaty komórkowe,
- liofilizaty,
- ekstrakty.
Testy ELISA są szeroko wykorzystywane w dziedzinie medycyny, diagnostyki laboratoryjnej i badaniach biologicznych. Mają one na celu wykrywanie i ilościowe lub jakościowe ocenianie obecności antygenów lub przeciwciał w próbkach biologicznych. Głównie testy ELISA znajdują zastosowanie w:
- Diagnostyce chorób zakaźnych
Testy ELISA są powszechnie stosowane do wykrywania obecności antygenów lub przeciwciał związanych z różnymi chorobami zakaźnymi, takimi jak HIV, wirusowe zapalenie wątroby (HCV), wirusowe zapalenie wątroby typu B (HBV), toksoplazmoza, borelioza i inne. Mogą one pomóc w identyfikacji pacjentów z infekcjami oraz monitorowaniu postępu leczenia.
- Diagnostyce chorób autoimmunologicznych
Testy ELISA są również stosowane do wykrywania przeciwciał skierowanych przeciwko własnym komórkom i tkanek organizmu, które są charakterystyczne dla chorób autoimmunologicznych, takich jak toczeń rumieniowaty układowy, reumatoidalne zapalenie stawów, czy celiakia.
- Badaniach alergiczności
Testy ELISA mogą pomóc w identyfikacji alergenów, które powodują reakcje alergiczne. Przykładem jest test skórny dla alergii, w którym próbka krwi pacjenta jest testowana na obecność przeciwciał IgE skierowanych przeciwko określonym alergenom.
- Badania laboratoryjnych
Testy ELISA znajdują zastosowanie w badaniach laboratoryjnych, takich jak ocena poziomu hormonów, cytokin, białek i innych substancji w próbkach biologicznych. Przykładowo, test ELISA może być stosowany do oceny poziomu insuliny u pacjentów z cukrzycą.
- Testach diagnostycznych w weterynarii
Testy ELISA są również używane w medycynie weterynaryjnej do diagnozowania chorób u zwierząt, takich jak choroba zwyrodnieniowa stawów u psów, wirusowe infekcje u bydła czy panleukopenia kotów.