Spektrometr masowy typu MALDI-TOF tworzy widma unikatowego profilu białkowego badanego mikroorganizmu (białka rybosomalne), tzw. molekularny „odcisk palca”, który jest następnie porównywany z referencyjną bazą danych. Dzięki tej technice uzyskujemy szybką i dokładną klasyfikację taksonomiczną nieznanych organizmów na poziomie rodzaju lub gatunku, w próbce badanej. Na wyniki analizy bakterii czeka się zaledwie klika minut, co w porównaniu z 24-48 godzinnym czasem potrzebnym do identyfikacji drobnoustrojów metodami biochemicznymi jest dużą oszczędnością czasu. Ma to ogromne znaczenie szczególnie w przypadku próbek klinicznych. Ponadto wykorzystanie spektrometrii mas typu MALDI-TOF umożliwia szybką identyfikację mikroorganizmów beztlenowych oraz takich, których nie można zidentyfikować metodami biochemicznymi.
Laboratorium Mikrobiologiczne Jagiellońskiego Centrum Innowacji posiada spektrometr masowy typu MALDI-TOF (Bruker Biotyper) oferując identyfikację mikroorganizmów z materiałów: biologicznych (w tym żywności i suplementów diety), farmaceutycznych, klinicznych, weterynaryjnych, środowiskowych i w badaniach innowacyjnych.
Korzystając z literatury naukowej w artykule tym skupimy się na przedstawieniu możliwości wykorzystania spektrometru masowego typu MADLI-TOF do identyfikacji mikroorganizmów z próbek klinicznych.
Sepsa
Sepsa nie jest samodzielną jednostką chorobową tylko specyficzną reakcją organizmu spowodowaną zakażeniem. Zgodnie ze współczesną nomenklaturą definiuje się ją jako „zagrażającą życiu dysfunkcję narządową spowodowaną zaburzoną regulacją odpowiedzi ustroju na zakażenie”1. Choć sepsa stanowi poważny problem na oddziałach intensywnej terapii, to może występować także w warunkach poza szpitalnych. Przyczyną sepsy może być każdy drobnoustrój, który w normalnych warunkach nie powinien stanowić dużego problemu dla organizmu. Jak pokazują badania Kumara i jego zespołu ryzyko zgonu wzrasta o 7% z każdą godziną między początkiem wstrząsu septycznego, a dostosowaniem terapii przeciwdrobnoustrojowej2. Co więcej, badania z 2003 i 2008 roku wyraźnie wykazały obniżenie kosztów leczenia sepsy przy wczesnym wykryciu patogenu odpowiedzialnego za wstrząs, a następnie zastosowaniu odpowiedniej antybiotykoterapii3,4.
Obecnie, po zdiagnozowaniu u pacjenta sepsy wykonuje się posiew krwi. Jeśli wynik jest dodatni laboratorium wykonuje bakterioskopię, która trwa ok. 1 godziny. Po tym czasie diagności posiadają częściowy wynik dzięki któremu, wiedzą czy mają do czynienia z bakteriami gram-dodatnimi, gram-ujemnymi czy grzybem drożdżopodobnym. Następnym etapem jest izolacja kolonii, która w przypadku bakterii trwa ok. 24 godziny, natomiast w przypadku grzybów ok. 5 dni. Ostateczna identyfikacja i testy wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe zajmują od 24 do 48 dodatkowych godzin. Dopiero po tym okresie publikowany jest raport laboratoryjny i dostosowywana najskuteczniejsza terapia. W tym czasie stan pacjenta pogarsza się z godziny na godzinę. Współpracując z doświadczonym laboratorium mikrobiologicznym, które dysponuje spektrometrem masowym typu MALDI-TOF identyfikacji mikroorganizmu można skrócić5.
Skrócenie czasu diagnostyki patogenu może uratować życie pacjenta, a także zaoszczędzić sporo czasu służby medycznej, a tym samym pieniędzy szpitala. Warto mieć świadomość, że naukowcy uważają ,że w kolejnych latach zapadalność na zakażenia krwiobiegu będą wzrastać o co najmniej 10% rocznie, powodując istotny wpływ społeczno-ekonomiczny na system opieki zdrowotnej6.
Badania krwi i moczu
Jak zostało wspomniane MALDI-TOF identyfikuje organizmy na podstawie ich unikatowego profilu białkowego. W tym celu mikroorganizmy muszą być wyizolowane z podłoży hodowlanych/ mediów hodowlanych. To zajmuje dodatkowy czas dlatego wielu naukowców zaczęło pracować nad specjalnymi protokołami, które ostatecznie pozwoliły na identyfikację drobnoustrojów bezpośrednio z dodatnich posiewów krwi i moczu. Jak się okazało lepsze wyniki w identyfikacji bakterii metodą MALDI-TOF MS osiąga się gdy dotyczy to bakterii gram-ujemnych.
Zespół Ferreira uzyskał dokładną identyfikację 83,3% bakterii gram-ujemnych i 31,8% bakterii gram-dodatnich w porównaniu z metodami tradycyjnymi7. Natomiast zespół Moussaoui za pomocą spektrometru masowego typu MALDI-TOF uzyskał aż 91,1% dokładnych identyfikacji bakterii gram-ujemnych i 89% gram-dodatnich8. Co więcej, badania prowadzone przez zespół Kohlmann wykazały, że już po 4 godzinach wstępnej hodowli MALDI-TOF jest cennym narzędziem do szybkiej identyfikacji patogenu z dodatnich posiewów krwi, umożliwiając łatwe włączenie do rutynowej diagnostyki i dające możliwość znacznie wcześniejszego dostosowania leczenia9. Wspomniany wyżej zespół Ferreira wykazał także 93,1% zgodność między identyfikacją bakterii bezpośrednio z próbek moczu metodą MALDI-TOF, a metodami tradycyjnymi. Trzeba jednak mieć świadomość, że choć identyfikacja mikroorganizmów za pomocą MALDI-TOF bezpośrednio z próbek klinicznych jest obiecującą metodą to protokoły niezbędne do jej przeprowadzenia wymagają dopracowania.
Identyfikacja bakterii beztlenowych
Bakterie beztlenowe są głównym składnikiem ludzkiej mikroflory znajdującej się na błonach śluzowych, dominują także w wielu infekcjach. Dotychczas, używając klasycznych i molekularnych metod, zidentyfikowano kilkaset różnych gatunków bakterii beztlenowych. Problemy techniczne związane z izolacją tych bakterii do czystej kultury oraz czasochłonne procedury potrzebne do prawidłowej identyfikacji nadal prowadzą do wielu przypadków, w których beztlenowa etiologia zakażenia pozostaje nierozpoznana. Dodatkowym problemem w leczeniu chorób spowodowanych bakteriami beztlenowymi jest wzrost oporności na antybiotyki u niektórych gatunków. Również w tym przypadku okazuje się, że prawidłowa i terminowa identyfikacja gatunku patogenu ma ogromne znaczenie w skutecznym leczeniu pacjenta10.
Największym problemem w diagnostyce bakterii beztlenowych jest trudność w zapewnieniu odpowiedniego środowiska beztlenowego.Co więcej, w jednej próbce może występować kilka gatunków bakterii beztlenowych o różnych poziomach tolerancji tlenowej, które dodatkowo mogą być w towarzystwie bakterii tlenowych. Kolejnym problemem jest fakt, że bakterie te powoli rosną dlatego ich hodowla wymaga stosunkowo długiego czasu, tym samym identyfikacja trwa nawet 7 dni11. Badania Nagy i jej zespołu wykazały, że MALDI-TOF prawidłowo zidentyfikował 86,2% losowo wybranych klinicznych izolatów beztlenowych (badania na 283 izolatach). Co więcej dowiedziono, że identyfikacja na poziomie gatunku za pomocą niższego logu (punktacji) niż zalecana przez producenta może być zaakceptowana, gdyż w większości przypadków potwierdzono ją za pomocą testów biochemicznych lub sekwencjonowania12.
Natomiast badania zespołu Justesen wykazały, że działanie MALDI-TOF zależy od wielu czynników, a odsetek prawidłowej identyfikacji można poprawić poprzez pomiary równoległe, a także za pomocą metody ekstrakcji, jeśli pierwszy pomiar metodą bezpośredniej kolonii nie dał identyfikacji na poziomie gatunku13.
Identyfikacja bakterii tlenowych
Każdego roku w Polsce dochodzi do ok. 200 zakażeń prątkami (Mycobacterium), które doprowadzają do mykobakteriozy. Choć prątki występują w naszych organizmach cały czas, to w przypadku osłabionej odporności może dojść do zakażenia. Badania prowadzone w Hiszpanii przez zespół Mediavilla-Gradolph na izolatach pobranych głównie z górnych dróg oddechowych wykazały, że MALDI-TOF jest dokładnym, szybkim i opłacalnym systemem identyfikacji gatunków prątków. Identyfikacja metodą MALDI-TOF była prawidłowa w 98,4% (65/66 izolatów) prątków niegruźliczych izolowanych w praktyce klinicznej (M. avium, M. intracellulare, M. abscessus, M. chelonae, M. fortuitum, M. mucogenicum , M. kansasii i M. scrofulaceum). Tak dobry wynik identyfikacji prątków jest o tyle ważny, że organizmy te obok grzybów, są jednymi z najtrudniejszych do oznaczenia tradycyjnymi metodami identyfikacji. Leczenie mykobakteriozy może trwać nawet 2 lata dlatego niezwykle istotne jest odpowiednie rozpoznanie gatunku, który doprowadził do choroby14.
Warto także zwrócić uwagę na procedurę opracowaną przez zespół Saleeb, gdzie zawiesinę bakteryjną ogrzewano przez 30 minut w temperaturze 95°C w celu uśmiercenia prątków i lizowanie mikroorganizmów przez worteksowanie zawiesiny szklanymi kulkami w obecności kwasu mrówkowego i acetonitrylu. Ponadto, wykazano, że praktycznie wszystkie gatunki prątków można zidentyfikować w ciągu 90-minut, czyli znacznie szybszym niż dni lub tygodnie, które w innym wypadku były wymagane do identyfikacji za pomocą sekwencjonowania lub testów biochemicznych15.
Szybka identyfikacja gronkowców z zakażeń protetycznych stawów
Każdego roku na całym świecie implanty ortopedyczne przyczyniają się do poprawy czynności i ustąpienia bólu u 2,7 milionów pacjentów. Jednakże większa ilość wykonywanych zabiegów wiąże się z większą liczbą powikłań16. Zakażenia związane z wszczepieniem wyrobu medycznego (implantu) uznawane są za jedne z najtrudniejszych do leczenia powikłań po zabiegach endoprotezoplastyki17. Najczęściej wywoływane są one przez gronkowce. Powszechnie znane metody identyfikacji tych bakterii są powolne, kosztowne i czasami zawodne. W badaniach przeprowadzonych przez zespół Harrisa oceniono zdolność MALDI-TOF w połączeniu z oprogramowaniem MALDI Biotyper do identyfikacji 158 scharakteryzowanych izolatów gronkowców z zakażeń protetycznych stawów, w tym 36 Staphylococcus aureus, 100 Staphylococcus epidermidis, 10 Staphylococcus capitis, 8 Staphylococcus lugdunensis, 2 Staphylococcus warneri i 2 Staphylococcus haemolyticus. Sugerowana identyfikacja gatunku za pomocą bazy MALDI Biotyper była poprawna dla wszystkich izolatów, wskazując na wiarygodne różnicowanie między S. aureus a gronkowcami koagulazo-ujemnymi18.
Identyfikacja grzybów drożdżopodobnych i strzępkowych
Współczesna medycyna charakteryzuje się ciągłym postępem. Niestety zjawisku temu towarzyszy wzrost liczby inwazyjnych zakażeń grzybiczych (IZG), które nie tylko utrudniają leczenie choroby podstawowej, ale także powodują groźne dla życia powikłania. Wzrost ten może być spowodowany powszechnym stosowaniem antybiotyków, przedłużającej się hospitalizacji krytycznie chorych i wzrastającej liczbie pacjentów z obniżoną odpornością. Z tego też powodu problem ten dotyczy głównie chorych przebywających na oddziałach intensywnej opieki medycznej, transplantologii, onkologii i hematologii.
Za patogeny ludzkie uznaje się obecnie ponad 100 gatunków grzybów. Ich identyfikacja przy użyciu powszechnie stosowanych metod fenotypowych jest trudna i długotrwała. Co więcej, oznaczenie gatunku może być niejednoznaczne, szczególnie gdy mamy do czynienia z którymś z mniej spotykanych grzybów drożdżopodobnych. Niezwykle ważne są doniesienia o skuteczności identyfikacji tej grupy patogenów przy użyciu metody MALDI TOF. Badania zespołu Bille wykazały, że 96,3% drożdży i 92,2% Aspergillus spp. zidentyfikowano po pojedynczym pasażowaniu. Po drugim pasażowaniu ogólny wskaźnik identyfikacji wyniósł 98,8% dla drożdży (160/162) i 98,4% (63/64) dla Aspergillus spp.19. Optymizmem napawają także badania przeprowadzone w 2018 roku w laboratorium Manitoba w Kanadzie. Zespół Steina porównał identyfikację pleśni wykorzystując do tego trzy bazy: bibliotekę Brukera, bibliotekę National Institutes of Health (NIH) oraz internetową bibliotekę Mass Spectrometry Identification (MSI) z tradycyjnymi i molekularnymi metodami identyfikacji. Wyniki otrzymane ze wszystkich 3 bibliotek miały większą dokładność w identyfikacji na poziomie rodzaju (≥94,9%) niż metody konwencjonalne (86,4%). W ramach tego projektu zidentyfikowano 73,3% izolatów na poziomie gatunkowym przy użyciu MALDI-TOF w porównaniu do zaledwie 31,7% metodami konwencjonalnymi. Również badania prowadzone we współpracy Jagiellońskiego Centrum Innowacji z Uniwersyteckim Szpitalem Dziecięcym w Krakowie potwierdzają niezwykłą skuteczność tej metody20.
Typowanie drobnoustrojów i testowanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe
Myśląc o coraz szerszym zastosowaniu spektrometru masowego typu MALDI-TOF naukowcy rozpoczęli prace nad jego wykorzystywaniem w typowaniu drobnoustrojów i testowaniu wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe. Przykładem mogą być badania prowadzone przez dwa zespoły Edwards-Jones’a21 oraz Du22. Opisali oni różne profile widmowe dzięki którym można rozróżnić gatunki Staphylococcus wrażliwe od tych, które są oporne na metycylinę. Jednak by badania te miały większe znaczenie to w przyszłości należałoby je rozszerzyć na inne izolaty kliniczne, a także na inne leki. Równie obiecujące wydają się być wyniki badań Murray’a. Naukowiec wskazał, że widma masowe są powtarzalne i rozróżniające dla typowania oraz, że otrzymane wyniki są porównywalne z konwencjonalnymi tj.tradycyjnymi metodami typowania23. Jeśli teza ta zostanie potwierdzona przez następne badania, to wówczas będzie można wykorzystać spektrometr masowy typu MALDI-TOF nie tylko do identyfikacji konkretnych mikroorganizmów, ale także do określenia, czy są one powiązane z innymi izolatami klinicznymi, a dzięki temu do przeprowadzenia prospektywnej epidemiologii.
Jak pokazują wszystkie powyższe badania oraz szereg innych, spektrometr masowy typu MALDI-TOF doskonale sprawdza się w diagnostyce klinicznej. Metoda ta pozwala zaoszczędzić czas, pracę służby zdrowia, a także pieniądze. Jest korzystna zarówno z perspektywy pacjenta jak i ośrodka medycznego. Jedynym czynnikiem blokującym korzystanie ze spektrometru masowego typu MALDI-TOF jest koszt jego zakupu. Rozwiązaniem tego problemu może być nawiązanie współpracy z laboratorium, który taki sprzęt już posiada. Jedną z takich firm jest Jagiellońskie Centrum Innowacji, które od lat współpracuje między innymi z Uniwersyteckim Szpitalem Dziecięcym w Krakowie oraz Centrum Badań Mikrobiologicznych i Autoszczepionek. Baza danych, z której korzysta JCI jest systematycznie aktualizowana i obecnie pozwala na identyfikację 4274 gatunków drobnoustrojów!
Źródła:
1. https://www.mp.pl/oit/wytyczne/165848,postepowanie-w-sepsie-i-wstrzasie-septycznym-u-doroslych-omowienie-wytycznych-ssc-2016
2. KUMAR A. et al. – Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Critical Care Medicine v. 34, n. 6, p. 1589-96, 2006
3. DELLINGER R. P. et al. – Surviving sepsis campaign: international guidelines for management of severe sepsis and septic shock: 2008. Critical Care Medicine v. 36, n. 1, p. 296-327, 2008
4. GARNACHO-MONTERO J. et al. – Impact of adequate empirical antibiotic therapy on the outcome of patients admitted to the intensive care unit with sepsis. Critical Care Medicine v. 31, n. 12, p. 2742-51, 2003
5. VERROKEN A. et al. – Reducing time to identification of positive blood cultures with MALDI-TOF MS analysis after a 5-h subculture. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases v. 34, p. 405-413, 2015
6. SANTOS A. F. et al. – Evaluation of MALDI-TOF MS in the microbiology laboratory (https://www.scielo.br/scielo.php?pid=S1676-24442013000300006&script=sci_arttext)
7. FERREIRA L. et al. – Microorganisms direct identification from blood culture by matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Clinical Microbiology and Infection v. 17, n. 4, p. 546-51, 2011
8. MOUSSAOUI W. et al. – Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vial. Clinical Microbiology and Infection v. 16, n. 11, p. 1631-8, 2010
9. KOHLMANN R. et al. – MALDI-TOF mass spectrometry following short incubation on a solid medium is a valuable tool for rapid pathogen identification from positive blood cultures. International Journal of Medical Microbiology v. 305, I. 4–5, p. 469-479, 2015
10. NAGY E. et al. – Study Group on Antimicrobial Resistance in Anaerobic Bacteria; Antimicrobial susceptibility of Bacteroides fragilis group isolates in Europe: 20 years of experience. Clinical Microbiology and Infection v. 17, p. 371-379, 2011
11. HOLDEMAN L. V. et al. – Anaerobe Laboratory Manual, 4th edn. Blacksburg, VA: Virginia Polytechnic Institute and State University, 1977
12. NAGY E. et al. – The value of MALDI-TOF MS for the identification of clinically relevant anaerobic bacteria in routine laboratories – Journal Of Medical Microbiology v. 61, I. 10, p. 1393-1400, 2012
13. JUSTESEN U. S. et al. – Species identification of clinical isolates of anaerobic bacteria: a comparison of two matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry systems. Journal of Clinical Microbiology v. 49, p. 4314-4318, 2011
14. MEDIAVILLA-GRADOLPH M. C. et al. – Use of MALDI-TOF MS for Identification of Nontuberculous Mycobacterium Species Isolated from Clinical Specimens. BioMed Research International v.1, p.1-6, 2015
15. SALEEB P. G. et al. – Identification of mycobacteria in solid culture media by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry Journal of Clinical Microbiology v. 49, p. 1790-1794, 2011
16. TREBŠE R. et al. – Czy rodzaj artykulacji ma wpływ na częstość występowania okołoprotezowych zakażeń stawu biodrowego? Cera News v. 1, p. 12-16, 2014
17. PARVIZI J. . et al. – Zakażenia związane z implantami: Triumf zarazków czy możliwe do uniknięcia powikłanie? Cera News v. 1, p. 6-8, 2014
18. LLINOS G. et al. – Rapid Identification of Staphylococci from Prosthetic Joint Infections Using MALDI-TOF Mass-Spectrometry. The International Journal of Artificial Organs v. 33(9), p. 568-74, 2010
19. BILLE E. et al. – MALDI-TOF MS Andromas strategy for the routine identification of bacteria, mycobacteria, yeasts, Aspergillus spp. and positive blood cultures. Clinical Microbiology and Infection v. 18, I. 11, p. 1117-1125, 2012
20. https://www.jagiellonskiecentruminnowacji.pl/wp-content/uploads/2019/01/nota_aplikacyjna_03_112018.pdf
21. EDWARDS-JONES V. et al. – Rapid discrimination between methicillin-sensitive and methicillin-resistant Staphylococcus aureus by intact cell mass spectrometry Journal of Clinical Microbiology v. 49, p. 295-300, 2000
22. DU Z. et al. – Wang Identification of Staphylococcus aureus and determination of its methicillin resistance by matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry v. 74, p. 5487-5491, 2002
23. MURRAY P. R. – Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry: usefulness for taxonomy and epidemiology. Clinical Microbiology and Infection v. 16, p. 1626-1630, 2010