WYSOKOSPRAWNA CHROMATOGRAFIA CIECZOWA
Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC, ang. high-performance liquid chromatography) to technika analityczna, która może być wykorzystywana do badania czystości oraz identyfikacji związków chemicznych, a w wersji preparatywnej może służyć do oczyszczania substancji z mieszanin. Jest to rodzaj cieczowej chromatografii kolumnowej, w której analizowana próbka jest rozpuszczana w odpowiednio dobranym rozpuszczalniku, a następnie kierowana na kolumnę, wypełnioną wybranym złożem porowatym lub żelowym, zwanym fazą stacjonarną W wyniku oddziaływań międzycząsteczkowych między związkami chemicznymi i wypełnieniem kolumny następuje rozdział substancji.
W porównaniu z klasyczną chromatografią kolumnową, HPLC różni się znacznie większym ciśnieniem w układzie, które wynosi przynajmniej kilkadziesiąt barów, a w niektórych przypadkach przekracza nawet kilkaset barów (UHPLC nawet 1000 barów). Wysokie ciśnienie wynika z budowy pomp HPLC, wąskich przekrojów kapilar i przepływu fazy ruchomej stosowanego w aplikacji. Drobniejsze ziarna fazy stałej w złożu przepływowym HPLC przyczyniają się do lepszych parametrów wydajności i rozdzielczości systemu. Dzięki temu można osiągnąć szybsze rozdzielenie składników mieszaniny chemicznej, przy mniejszym zużyciu eluentu i mniejszej ilości próbki do analizy w porównaniu do klasycznej chromatografii kolumnowej, a zdolności rozdzielcze są niekiedy porównywalne do tych z chromatografii gazowej. Metoda HPLC umożliwia dokładną separację i identyfikację składników mieszanin, co pozwala na określenie ich składu oraz ilości w badanych próbkach.
W HPLC duże znaczenie dla rozdziału ma polarność faz. Obecnie najczęściej stosuje się odwrócony układ faz (RP, ang. reverse phase), w którym faza ruchoma jest bardziej polarna niż faza stacjonarna. Zależność ta wynika z oddziaływań między hydrofobowymi cząsteczkami substancji rozpuszczonej a fazą stacjonarną oraz hydrofobowymi ligandami związanych z fazą stacjonarną. Siła i charakter oddziaływania między cząsteczkami próbki i fazą stacjonarną zależy zarówno od oddziaływań hydrofobowych, jak i oddziaływań polarnych.
Wysokosprawna chromatografia cieczowa jest techniką, która jest niezwykle pomocna w wielu dziedzinach nauki, takich jak chemia, farmacja, medycyna, biologia, czy ochrona środowiska. Dzięki swoim zaletom, takim jak wysoka czułość, selektywność i precyzja, HPLC, umożliwia wykrycie nawet niewielkich ilości związków, co czyni ją niezastąpioną i często stosowaną w badaniach jakościowych i ilościowych związków chemicznych w różnego rodzaju próbkach.
ANALIZA ILOŚCIOWA HPLC
Analiza ilościowa w chromatografii HPLC opiera się na pomiarze związków chemicznych w próbce, która została rozdzielona przez kolumnę chromatograficzną. Analiza ilościowa w chromatografii HPLC opiera się na pomiarze powierzchni pików chromatograficznych związków chemicznych w próbce, która została rozdzielona na kolumnie chromatograficznej ze względu na ich właściwości fizykochemiczne, takie jak rozpuszczalność, polarność, kwasowość lub zasadowość.
Stężenie próbki jest określane na podstawie pomiaru próbek substancji wzorcowych o znanych stężeniach. Istotne jest również zastosowanie odpowiedniego detektora. Najczęściej wykorzystywanym detektorem w HPLC jest detektor spektrofotometryczny UV-VIS. Detektor ten umożliwia pomiar absorbcji światła przez związki chemiczne, co pozwala na identyfikację i analizę ilościową.
Przy obliczaniu ilościowej zawartości składników w próbce, wykorzystuje się fakt, że ilość tych składników jest proporcjonalna do powierzchni lub wysokości pików chromatograficznych, które odpowiadają tym składnikom. Dla uzyskania większej czułości można niekiedy zastosować detektor absorpcji w nadfiolecie, ponieważ charakteryzuje się on wysoką czułością i szerokim zakresem liniowości. Ważne jest odpowiednie dobranie warunków detekcji, na przykład długość fali odpowiadająca maksimum absorpcji.. Wyniki badania w dużej mierze zależą także od jakości używanego przyrządu chromatograficznego oraz stałych warunków fizykochemicznych podczas przeprowadzania analizy. W trakcie analizy próbek badanych oraz ich wzorców Temperatura kolumny, skład fazy ruchomej i wielkość próbek dozowanych do kolumny nie powinny ulegać zmianie.
W chromatografii cieczowej istnieją różne metody kalibracji w analizie ilościowej. Można to zrobić, w zależności od rodzaju oznaczenia, stosując krzywą kalibracyjną, metodę dodatku wzorca lub współczynnik odpowiedzi. Inną wykorzystywaną metodą jest metoda wzmacniania próbki wzorcem, polegająca na dodaniu znanego wzorca do próbki i porównaniu pików chromatograficznych przed i po jego dodaniu.
Analiza ilościowa w chromatografii HPLC wymaga precyzyjnego przestrzegania procedur i standardów jakościowych. Ważne jest również wykorzystanie odpowiednich narzędzi i sprzętu laboratoryjnego oraz dobór optymalnych warunków analizy, takich jak rodzaj kolumny, rodzaj i skład fazy ruchomej, temperatura, ciśnienie i przepływ. Przy wykorzystaniu techniki HPLC można przeprowadzać analizę ilościową wielu związków chemicznych, w tym aminokwasów, hormonów, leków, witamin, a także substancji organicznych i nieorganicznych.
Jagiellońskie Centrum Innowacji dysponuje wieloletnim doświadczeniem w realizacji usług analitycznych oraz doradczych z zakresu analizy ilościowej HPLC. Laboratorium Chromatografii i Spektrometrii Mas posiada wdrożony System Zarządzania Jakością, zgodnie z wymaganiami normy ISO 9001:2015 oraz Zezwolenie na wytwarzanie produktów leczniczych w zakresie badań fizykochemicznych wydane przez Główny Inspektorat Farmaceutyczny (o numerze 262/0584/21) co pozwala na prowadzenie analiz zwolnieniowych.
Dodatkowo realizujemy także usługi w zakresie analiz jakościowych i ilościowych z wykorzystaniem technik spektrometrii mas (QTOF) oraz chromatografii cieczowej (HPLC, UHPLC), chromatografii gazowej (GC) oraz chromatografii w stanie nadkrytycznym CO2 (SFC) z różnymi technikami detekcji.
Jeżeli jesteś zainteresowany przeprowadzeniem analizy ilościowej HPLC, bądź innych oznaczeń w Laboratorium Chromatografii i Spektrometrii Mas skontaktuj się z:
Kontakt w sprawie oferty:
dr Dominika Szot-Przewrocka
E: dominika.szot.przewrocka@jci.pl